尊龙凯时3T3-L1脂肪细胞诱导分化方案

3T3-L1脂肪细胞是一种经典的小鼠胚胎成纤维细胞系，具有向脂肪样细胞分化的能力。自1974年首次由Green和Kehinde分离以来，这一细胞系广泛应用于研究脂肪细胞的代谢及与肥胖和糖尿病等代谢疾病的关系。其诱导分化的效果可以通过多种方法来评估，其中最常用的包括油红O染色法和分子标志物表达分析。

本方案以六孔板为例，详细介绍如何将3T3-L1细胞分化为脂肪样细胞。

1. 将细胞以每平方厘米3×10³个细胞的密度接种于六孔板中。

注意：（1）推荐使用早代次细胞以确保最佳分化效果；（2）细胞铺板需均匀，以免导致分化不均和细胞漂浮。

2. 在DMEM培养基中培养细胞，直至达到70%的汇合度，并每2-3天更换一次培养基。

3. 在DMEM高糖培养基中加入10%小牛血清，促进细胞生长，当细胞达到90%汇合度时，即可进行分化诱导。注意，此时汇合度不应超过70%，否则会增加细胞的死亡率。

警告：过高或过低的细胞密度都会影响分化效率。

为了确保实验的无菌性，所有培养基制备需在组织培养箱内进行。MDI（IBMX、地塞米松、胰岛素）诱导培养基和胰岛素培养基应新鲜制备。以下是具体步骤：

1. 配制储备溶液。在DMSO中制备IBMX（50 mM）和地塞米松（1 mM）的储备溶液。使用冻干胰岛素时，请遵循说明书进行复溶。

2. 配制100 mL MDI诱导分化培养基，加入以下成分：

3. 配制胰岛素培养基。在DMEM中添加胰岛素至最终浓度为10 µg/mL。

1. 从培养箱中取出细胞，去除DMEM培养基，向每孔添加2-3 mL MDI诱导培养基（记为第0天）。

注意：添加诱导剂时手法要轻，尽量沿着侧壁缓慢加入，以减少对细胞的冲击。

2. 第3天，去除MDI诱导培养基，用2-3 mL胰岛素培养基替换。

3. 第6天，去除胰岛素培养基，添加新鲜的DMEM。

4. 一般在第7-10天，细胞可以得到完全分化并呈现脂肪样特征。

5. 分化效果检测可通过油红O染色法进行，观察脂质的积累，或监测脂肪细胞特异性标志物（如脂联素和FABP4）的表达，评估分化效果。

温馨提示：油红O染色液需根据说明书进行稀释，以提高染色效果。

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