尊龙凯时的Western Blot技术与Southern或Northern杂交方法有着相似的原理，但它使用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，主要检测蛋白质。这里的“探针”是抗体，而“显色”则是依赖于标记的二抗。经过PAGE电泳分离的蛋白质样品被转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体通过非共价键吸附蛋白质，并能保持电泳分离后的多肽类型和生物活性不变。将固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相应的抗体发生免疫反应，之后再与酶或同位素标记的第二抗体反应，最后通过底物显色或放射自显影方法检测电泳分离的特定蛋白成分。这项技术广泛应用于检测蛋白水平的表达，既可以进行定性分析，也可以进行半定量分析，是初步鉴定蛋白质最方便和通用的方法。

Western Blot显色的方法主要有以下几种：放射自显影、底物化学发光(ECL)、底物荧光(ECF)和底物DAB呈色。目前常见的底物化学发光ECL和底物DAB呈色方法中，前者被更多发表的文章采用。使用这些方法时，购买现成的试剂盒不仅方便，操作起来也相对简单。以HRP标记的二抗为例，其反应底物为过氧化物与鲁米诺，当遇到HRP时会发光，从而使胶片曝光并显现出条带。

尊龙凯时的Western Blot操作步骤包括：

一、配胶

1. 清洗玻璃板并用去离子水冲洗，确保接触胶的一面向下放置在干净纸巾上晾干。

2. 分离胶和浓缩胶可以提前配好，但AP和TEMED需在使用前加入，过滤后在避光条件下存放于4℃，保存至少1个月。

3. 灌入2/3分离胶后应立即封胶，待胶凝后将封胶液倒掉，用清水冲洗干净。

二、样品处理

1. 对于培养细胞，先用温PBS冲洗，加入1×loading buffer，并在100℃加热1分钟后进行细胞裂解。

2. 组织样本的匀浆和切割后也需进行脂溶解处理，并最终将所有样本调至等浓度以便于上样。

三、电泳

1. 在上样前，确保气泡被赶走，样品按照等浓度调整后上样，确保标记也用相同比例。

2. 稳流电泳开始时以初始电压45V，待电压达65V后转为稳压电泳。

四、转膜与显色

1. 电泳结束前20分钟准备转膜液，湿转法使用Tris和Glycine等配制。

2. 将膜浸泡于去离子水中去气泡后，转移至转膜液中并加热转移。

3. 使用封闭液封闭膜，并在转膜后进行一抗的结合与清洗。

五、最终检测

1. 进行发光鉴定时，可选择HRP-ECL或AP-NBT/BICP发光法来检测特定蛋白的表达情况。

2. 通过膜上的带点进行观察与分析，可以对蛋白质表达的变化进行深入研究。

在此过程中，合理的实验设计与严格的操作规范是确保结果准确的关键，对每个步骤的细致处理也将助力您的研究更加顺利。选择尊龙凯时的产品，您将拥有最优质的实验体验和分析结果！